【試劑盒用途】 定量檢測(cè)人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的含量。 【檢測(cè)原理】 本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本加入到預(yù)先包被人高遷移率族蛋白B1（HMGB1）單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標(biāo)工作液，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根過氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中人高遷移率族蛋白B1（HMGB1）濃度呈正相關(guān)，450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，計(jì)算樣本中人高遷移率族蛋白B1（HMGB1）含量。 【試劑盒組成】 | 1 | 酶標(biāo)包被板 | 12孔×8條 | 7 | 顯色劑A液 | 6mL | | 2 | 標(biāo)準(zhǔn)品：80ng/mL | 0.6mL | 8 | 顯色劑B液 | 6mL | | 3 | 20倍濃縮洗滌液 | 25mL | 9 | 終止液 | 6mL | | 4 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 6mL | 10 | 說明書 | 1份 | | 5 | 樣本稀釋液 | 6mL | 11 | 封板膜 | 2張 | | 6 | 酶標(biāo)試劑 | 6mL | 12 | 密封袋 | 1個(gè) | 備注：標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：80、40、20、10、5、2.5ng/mL 【需要而未提供的試劑和器材】 1、37℃恒溫箱 2、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀 3、精密移液器及一次性吸頭 4、蒸餾水 5、一次性試管 6、吸水紙 【操作步驟】 1、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。 2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。 3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測(cè)樣本孔中先加入待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對(duì)照孔不加。 4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。 5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說明書操作洗板）。 6、加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對(duì)照孔不加。 7、溫育：重復(fù)4的操作。 8、洗板：重復(fù)5的操作。 9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，37℃避光顯色15min。 10、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 11、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。 12、計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算。zui終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。 【樣本要求】 1、樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因?yàn)榀B氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。 2、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能立即試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。 【注意事項(xiàng)】 1、實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。 2、酶標(biāo)包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。 3、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照都做雙份檢測(cè)，取平均值，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。 4、牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍，計(jì)算結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。 5、本試劑盒定量范圍為2.5-80ng/mL，超過此范圍，為標(biāo)準(zhǔn)曲線延伸計(jì)算所得，不做為準(zhǔn)確定量結(jié)果，請(qǐng)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋后測(cè)定準(zhǔn)確結(jié)果（2.5-80ng/mL范圍內(nèi)），乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。 6、若顯色過淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)底物溫育時(shí)間。 7、為避免交叉污染，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照每加一個(gè)就要更換一次吸頭；酶標(biāo)工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。 8、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號(hào)的試劑不得混用。 9、底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。 【操作程序總結(jié)】 準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品 加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30分鐘 洗板4次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30分鐘 洗板4次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘 加入終止液 15分鐘之內(nèi)讀OD值 計(jì)算 【檢測(cè)范圍】 2.5-80ng/mL 【規(guī)格】 96人份/盒 【貯藏】 2-8℃，避光防潮保存。 【有效期】 6個(gè)月 |
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